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Invitrogen-Gateway要领酵母双杂交文库构建(核体系取膜体系)和酵母单杂交文库构建(核体系)

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我们能够供应基于invitrogen的gateway要领的文库构建体系,该体系具有以下长处:

   1)我们从mRNA为模板间接停止cDNA单链的分解,没有经由任何扩增的历程,包管了文库的质量和忠厚性。 

   2)运用目前市场下质量的反转录酶,包管文库的片断长度和全长率,一般文库的全长率会正在50%以上。    

   3)运用gateway高效率的片断和载体重组衔接要领,衔接效力很下,能够大大进步原始文库的库容量(能够到达1*10^7 CFU 以上的原始文库库容量)。 

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  • 产物详情

服务报价:3万元整,免费赠予3个读码框处置惩罚,以确保卵白能够一般表达。

能够挑选增添供应转化到酵母的文库(增添4000.00元),能够供应充足100次挑选的酵母转化菌液文库,同时借会供应质粒文库。

可选均一化处置惩罚(增添3000.00元),能够有用进步低丰度基因挑选检出率。

服务工夫:25个工作日内 


我们具有多年的文库构建履历,已完成数千个各种文库构建,我们构建文库的成功率为98%以上。 

一、澳门金沙城娱乐场官网:

 我们能够供应基于invitrogen的gateway要领的文库构建体系,该体系具有以下长处:

       1)我们从mRNA为模板间接停止cDNA单链的分解,没有经由任何扩增的历程,包管了文库的质量和忠厚性. 

       2)运用目前市场上下质量的反转录酶,包管文库的片断长度和全长率,一般文库的全长率会正在50%以上。       

       3)运用gateway高效率的片断和载体重组衔接要领,衔接效力很下,能够大大进步原始文库的库容量(能够到达1*10^7 CFU 以上的原始文库库容量)。 

       4)该体系的文库会有低级文库供应,低级文库的载体为pDONR221,能够轻易天将该样本的文库再构建到其他恣意载体上,构成其他用处的文库,好比:pPR3-N、PET22b、PET19b、pYD1、pPRC9K、pLenti6.3、pET32b、pDest52、pDEST17等恣意载体。

 但该要领相对我们的All-Direct体系也有一些瑕玷:

        1.因为Gateway体系的重组臂是转变的,并且attL重组臂里带有停止密码子,且这个重组臂有100多个碱基,很少,为了削减重组臂对卵白表达的影响,不能不经由2次重组,以让终究文库的载体里不会带有attL重组臂,但照样会引入一个20多个碱基的attB重组臂,对表达或多或少照样有一点影响。

        2.因为必需经由2步重组,便需求停止低级文库的转化,摇菌扩增,质粒提取历程,而摇菌历程类似于PCR扩增的历程,是一个快速扩增的历程,这个历程中会存在基因之间的竞争性抑制效应,会形成高丰度的基因占的比例愈来愈多,低丰度的比例愈来愈少以至丧失,而许多公司接纳液体造就的体式格局,越发大大的增添了这个丧失效应,据我们的多年履历数据,每经由一次扩增和质粒提取历程,高丰度的基因取低丰度的基因拷贝数差别会扩大20倍以上,文库的均匀插入片断会低落200bp阁下。若是之前有做均一化处置惩罚,那一步的扩增,便根基会抵消均一化的感化。我们公司低落消弭摇菌扩增的影响,做了一些技术上的革新,但照样会有一些影响的。

我们公司有别的一套All-direct体系的文库构建,相对gateway要领,长处是制止了一次低级库的构建和菌液扩增和质粒提取步调,能够制止gateway要领的一些瑕玷,且重组效力等目标取gateway要领同等。瑕玷是,infusion要领不太合适一个样本一次的RNA星散和cDNA分解,同时构建到3个以上的载体上,能够一次同时构建到1-3个载体,构成1-3个文库,关于绝大多数状况,其实不需求将一个样本构建到多个文库载体上,这个充足知足需求了。


二、实行步调

2.1.RNA提取 

2.2.mRNA星散 

2.3.cDNA分解(运用酶促法间接分解,不经由PCR扩增历程,比SMART要领质量大大进步) 

2.4.cDNA长度分级(和均一化处置惩罚)

2.5.分级后的cDNA取pDONR221载体停止gateway BP重组,构成低级文库。

2.6 低级文库的电转化和涂板造就。

2.7 低级文库检测。

2.8 低级文库铺板扩增和质粒提取。

2.9 低级文库质粒取酵母文库载体pGADT7(pGADT7-Rec2)停止gateway LR重组,构成次级文库。

2.10 次级文库的电转化和涂板造就。

2.11 次级文库检测。

2.12 次级文库铺板扩增和质粒提取。

2.13 包装和发货

三、产物内容 

    1)低级文库的甘油菌液(露20%甘油的LB培养基)

      2)酵母文库的甘油菌液(露20%甘油的LB培养基)

      3)低级文库质粒

      4)酵母文库质粒,

      5)随机克隆子的PCR审定图谱

      6)文库构建讲演。

四、质量标准   (低级文库和次级文库目标雷同)

      3.1 文库库容量:大于1*10^7CFU。

      3.2 均匀插入片断:大于1.2Kbp。

      3.3 阳性率:大于95%。  

五、服务工夫

      25个工作日内

      如需转化酵母延伸15个工作日。 

六、质料要求:

 客户构建指定的酵母双杂交cDNA文库,由客户供应构造、细胞或总RNA给我们便可:

 细胞样本:细胞数目大于1*10^7 
 植物样本:大于1g 
 动物样本:大于2g 
 总RNA:大于500ug 

七、客户案例:

       现在我们曾经胜利完成数千个差别样本的文库构建,重要客户为中国科学院上海动物心理生态研究所、上海交通大学、浙江大学、浙江省农科院、山东省农科院等多家单元完成酵母单(单)杂交文库构建服务,物种包孕人、小鼠、大鼠、水稻、拟南芥、牡丹、稻飞虱、苹果、油菜、小麦、贝壳、葡萄、真菌等。

八、文库挑选:

       我们是海内极少数能同时供应文库构建和文库挑选的公司,关于酵母双杂交挑选服务,您只需求供应钓饵基因序列便可,我们会停止以下事情,挑选的报价为3万元整:

     1.钓饵载体的测序考证和构建到双杂交挑选载体上
     2.钓饵基因的自激活检测,检测经由过程后继承下一步实行。
     3.钓饵质粒转化酵母细胞,考证及格后再转化文库质粒
     4.酵母挑选和3AT前提优化
     5.挑选效果的测序
     6.挑选效果的回转考证
     7.挑选效果递交:包孕挑选讲演,挑选效果的测序效果和blast效果,挑选效果克隆的质粒什物。

九、FAQ:

9.1. 怎样挑选适宜的文库构建要领停止建库?

      我们是市场上能够同时供应3种文库构建要领的公司,那也足以看出我们公司的手艺气力。
3种要领的对照以下:

      1) Clonetech 的SMART要领,该要领根基是被镌汰的,我们上文有具体的手艺对照,其优点就是RNA的肇端量能够很小,一样平常只需求几ug便可,该要领本钱很低,一样平常不发起挑选。

      2) Invitrogen的要领,该要领质量上较SMART要领要好许多,其对试剂的质量要求也很高,需求全部运用invitrogen的本厂试剂。我们全部运用invitrogen公司试剂停止构建,且做了一些手艺革新,进步了文库质量。该要领对肇端的RNA要求较下,发起肇端用量是大于200ug。但该要领有一个严峻的瑕玷,就是需求停止两次重组才气获得酵母文库,而多一次重组就会多一次文库扩增历程,会严峻影响文库质量。正在上文中有具体的手艺对照和引见。
       其余运用该要领建库的公司,只能运用商业化的试剂盒构建文库,没有做任何革新。且因为进货渠道的缘由,试剂盒内的有些试剂他们是购不到的,质量就会大打折扣。好比DH10B 电转化感受态细胞,这个感受态细胞转化效力比国产的下出100倍以上。这个感受态细胞需求具有一堆的海关批文才气购到,其他公司因为没有相干天资,是没法入口的,据我们相识,海内某公司竟然会用化学转化细胞替代电转化,质量影响伟大。

       3) All-Direct要领,这个是我们的革新要领,是正在invitrogen要领上做了主要革新,保存了其长处(不消PCR扩增,文库保真度下),去除了其需求经由两次重组的瑕玷,大大进步文库质量。均匀长度较invitrogen要领能够进步200bp,库容量能够进步10倍以上。该要领对RNA的要求量和invitrogen要领一样。

9.2. 海科生物供应的酵母单杂文库有哪些产物内容?

       我们供应的文库产物,包含了文库质粒(大于500ug)和大肠杆菌文库甘油菌。同时能够挑选供应转化到酵母细胞的文库甘油菌,我们会供应100只转化到酵母细胞的文库甘油菌,能够做100次的文库挑选。
       个中文库质粒能够运用共转的要领停止文库挑选,酵母细胞文库甘油菌能够运用maiting的要领停止文库挑选,凭据先生的实行风俗能够自由选择,效果没有任何差别的。

9.3. 怎样检测文库质量?

       关于文库的质量,一个简朴的金尺度就是,样本内的所有基因皆正在文库里,且基因要有一半以上的全长基因,这个文库就是及格的。
       关于文库的检测,能够针对我们托付的产物,做以下几个方面的检测:
       凭据先生的样本信息,挑选3-5个低拷贝的基因,设想分解引物,以我们供应的文库质粒为模板,停止PCR扩增,若是低拷贝的基因皆能扩增出来,下拷贝的便不会丧失,文库质量便可以判定为及格。
        关于我们供应的大肠杆菌文库甘油菌,能够停止梯度稀释后铺板造就,第二天盘算库容量,同时挑与单克隆停止PCR扩增和测序检测,以判定插入片断长度和空载率。

9.4. 怎样评价文库质量?

       文库质量的要害目标,重要是文库库容、空载率及插入片断均匀长度。
       文库的原始库容一定是越高越好,我们公司许诺的是大于1*10^7的库容量,这个是原始库容量,也就是没有经由任何扩增历程,间接转化出来的库容量。比其他公司许诺的1*10^6的库容量要高10倍以上,上面具体注释下库容量的上下对文库质量的影响:
       生物样本,除低等生物,现在研讨对照多的物种,好比人,大鼠,小鼠,其基因数正在5*10^4阁下,文库最少得100倍掩盖,也就是库容最少需求5*10^6以上。
       关于动物样本,其基因数目比人的大许多,好比水稻样本,其基因数目为人的2-3倍,小麦样本,其基因数目为人的5-6倍,如许便需求更多的文库库容量。关于水稻样本,需求掩盖100倍的基因数,要求的文库原始库容量是大于1*10^7以上。市场上其余公司供应的文库只能掩盖10倍阁下,这么低的掩盖度,一定形成大量基因的丧失。
       关于有的公司宣扬的,库容量不是越高越好,那是不负责任的忽悠,为本身的文库质量不合格找不合理的托言。
       关于插入基因长度,其余公司一样平常均匀长度便正在800bp阁下,我们公司能够许诺做到1200bp以上,这个差异是伟大的,上面再具体引见下插入片断长度对文库质量的影响:
      一样平常的一个功用基因,其一样平常长度会正在200个氨基酸以上,也就是编码区正在600bp碱基以上,装入文库的基因,除编码区,还会有5’UTR区,3‘UTR区和polyA地区,那几个局部加起来,基因的长度一样平常最少会正在1000bp以上。因为文库是个混合物,会存在竞争性抑制,短的基因过多,必将会影响长度基因的比例,和少的基因的表达歉度。
       我们的文库产物,插入片断均匀长度会正在1200bp以上,短的会正在1000bp阁下。关于文库挑选,不是道只要有基因的一个片断便能够了,蛋白质的功用需求多种身分的到场,若是插入基因过短,挑选到的效果只是一个基因片断,以至是接近polyA的一小段基因,这个效果的可行度正在那里?根基皆能够以为是假阳性的效果的。
       关于有些公司声称的,文库的基因插入片断不是越长越好,实在是对客户的极为不负责任和不合理的忽悠,只是由于本身没有手艺做到更长的片断长度,而找的来由。

9.5. Mating和共转两种筛库要领哪种好?

       共转和maiting两种要领,结果是一样的,只是一个文库质粒转到酵母细胞的要领,关于后续的文库挑选没有区分的,能够凭据先生的实行风俗,自由选择的。


9.6 公司文库构建和挑选履历有多久?

       本公司处置各种文库构建和挑选长达10多年,特别是酵母文库,是海内一向完整本身做文库构建和挑选的公司。不像有的公司声称有10多年文库构建履历,实际上真实情况是其invitrogen体系的文库构建履历只要2-3年,2-3年前其所有的invitrogen体系文库都是外包给某公司做的,只是个二道贩子罢了,因为本身一向做欠好,才不能不一向外包。文库构建和挑选,履历很重要,少的履历积聚,能够包管产品质量和稳定性,一次成功率等。



十、客户文章示例

核蛋白酵母双杂交文库客户文章示例:

【1】Yeast-2-Hybrid data file showing progranulin interactions in human fetal brain and bone marrow libraries[J],Data in Brief, Volume 9, December 2016, Pages 1060-1062

【2】Zhenhai Yu, Yingying Ge, Lei Xie,et al. Using a yeast two-hybrid system to identify FTCD as a new regulator for HIF-1α in HepG2 cells[J],Cellular Signalling, Volume 26, Issue 7, July 2014, Pages 1560-1566

【3】Zhanyang Yu,1 Ning Liu,1 Yi Wang,2 Xiaokun Li,et al. Identification of Neuroglobin-interacting Proteins Using Yeast Two-hybrid Screening. Neuroscience. 2012 Jan 3; 200: 99–105.

【4】Cui LG, Shan JX, Shi M, et al. DCA1 Acts as a Transcriptional Co-activator of DST and Contributes to Drought and Salt Tolerance in Rice. PLoS Genet. 11, e1005617 (2015).

【5】Jing Ning, Baocai Zhang, Nili Wang, Increased Leaf Angle1, a Raf-Like MAPKKK That Interacts with a Nuclear Protein Family, Regulates Mechanical Tissue Formation in the Lamina Joint of Rice. The Plant Cell, Vol. 23: 4334–4347, December 2011.

【6】Raksha Singh, Mi-Ok Lee, Jae-Eun Lee, Jihyun Choi, Rice Mitogen-Activated Protein Kinase Interactome Analysis Using the Yeast Two-Hybrid System. Plant Physiology, September 2012.Vol.160,

【7】X.F.Zha, M.Zhao, C.Y.Zhou, H.Z.Guo. Analysis of interaction between Bmhrp28 and BmPSI in sex-specific splicing of Bombyx mori Bmdsx gene. Genetics and Molecular Research 13 (3): 5452-5462 (2014)

【8】Chao Zhang, Rongchao Ge, Junwen Zhang, Identification and Expression Analysis of a Novel HbCIPK2-Interacting Ferredoxin from Halophyte H. brevisubulatum.PLOS. December 4, 2015.

【9】Deng X1, Guo D2, Yang S1, Shi M1, Chao J1, Li H2, Peng S2, Tian W1. Jasmonate signalling in the regulation of rubber biosynthesis in laticifer cells of rubber tree, Hevea brasiliensis. J Exp Bot. 2018 Jun 27;69(15):3559-3571. doi: 10.1093/jxb/ery169.


酵母单杂交文库客户文章示例:

【1】Nobutaka Mitsuda,Miho Ikeda,Shinobu Takada,et al.Efficient Yeast One-/Two-Hybrid Screening Using a Library Composed Only of Transcription Factors in Arabidopsis thaliana.Plant Cell Physiol (2010) 51 (12): 2145-2151.

【2】Chang-Qing Yang1, Xin Fang1, Xiu-Ming Wu1, et al. Transcriptional Regulation of Plant Secondary Metabolism. Journal of Integrative Plant Biology 2012, 54 (10): 703–712

【3】Zejun Huang, Zhijin Zhang, Xiuling Zhang,et al. Tomato TERF1 modulates ethylene response and enhances osmotic stress tolerance by activating expression of downstream genes. FEBS Letters.Volume 573, Issues 1–3, 27 August 2004, Pages 110-116

【4】Deng X1, Guo D2, Yang S1, Shi M1, Chao J1, Li H2, Peng S2, Tian W1. Jasmonate signalling in the regulation of rubber biosynthesis in laticifer cells of rubber tree, Hevea brasiliensis. J Exp Bot. 2018 Jun 27;69(15):3559-3571. doi: 10.1093/jxb/ery169.

膜蛋白双杂交文库客户文章示例:

【1】Yasuyuki Nakamura, Jun Ishii, Akihiko Kondo. Rapid, Facile Detection of Heterodimer Partners for Target Human G-Protein-Coupled Receptors Using a Modified Split-Ubiquitin Membrane Yeast Two-Hybrid System.PLOS one. June 2013 , Volume 8 ,Issue 6.

【2】Zhe Ma, Hui Zhang, Junxi Zheng. Interaction between M-Like Protein and Macrophage Thioredoxin Facilitates Antiphagocytosis for Streptococcus equi ssp. Zooepidemicus.PLOS one. February 2012 ,Volume 7, Issue 2.

【3】Pratima Pandey and Singh Harbinder. The Caenorhabditis elegans D2-like dopamine receptor DOP-2 physically interacts with GPA-14, a Gαi subunit. Pandey and Harbinder Journal of Molecular Signaling 2012.

 中文论文:

【1】张云云,周 君, 李 晔. 适口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)酵母双杂交文库和铁联合卵白实核表达载体的构建. 陆地取湖沼,44卷,第6期。

【2】欧阳沫, 唐潇,黄惜,袁红梅。巴西橡胶树HbICE1 基因酵母双杂交钓饵载体的构建及互做卵白的挑选。动物科学学报,2016,34(2): 255~262.

【3】岳珊珊,夏来新。酵母双杂交挑选取果蝇C(2)M相互作用的卵白。遗传,2015.11,37(11)

【4】专利:一种联合串连反复序列(TTTACAC)5的Dof蛋白质



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