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酵母三杂交文库挑选服务

取酵母双杂交体系雷同,三杂交体系也是应用转录激活子调控实核基因转录的特性,很多转录激活子由构造上可分而功用上自力的两个构造域构成。如酵母Gal4转录激活子包孕DNA联合域(DNA binding domain,DNA-BD)和转录激活域(activation domain,AD)。将DNA-BD取钓饵卵白X融会,AD取靶卵白Y融会,离别构建BD-X和AD-Y重组质粒载体,并正在酵母细胞中共表达。若是钓饵卵白X取靶卵白Y相互作用,DNA-BD和AD互相接近,重构成有活性的Gal4转录激活子,DNA-BD取上游激活序列(UAS)联合,而AD则激活下流讲演基因(如lacZ或HIS3)的转录。经由过程检测β-半乳糖苷酶活性可肯定LacZ基因的表达程度。另外,HIS3编码咪唑甘油磷酸脱氢酶(His3p),能使酵母正在组氨酸缺点培养基上发展。3-氨基-1,2,4三唑(3-AT)是His3p的竞争性抑制剂,His3p表达程度下的细胞能正在含有较下3-AT浓度的培养基上发展,因而,酵母细胞对3-AT的抑止程度表现了卵白-卵白相互作用的强度。


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酵母三杂交文库挑选:


1.实行道理

取酵母双杂交体系雷同,三杂交体系也是应用转录激活子调控实核基因转录的特性,很多转录激活子由构造上可分而功用上自力的两个构造域构成。如酵母Gal4转录激活子包孕DNA联合域(DNA binding domainDNA-BD)和转录激活域(activation domainAD)。将DNA-BD取钓饵卵白X融会,AD取靶卵白Y融会,离别构建BD-XAD-Y重组质粒载体,并正在酵母细胞中共表达。若是钓饵卵白X取靶卵白Y相互作用,DNA-BDAD互相接近,重构成有活性的Gal4转录激活子,DNA-BD取上游激活序列(UAS)联合,而AD则激活下流讲演基因(如lacZHIS3)的转录。经由过程检测β-半乳糖苷酶活性可肯定LacZ基因的表达程度。另外,HIS3编码咪唑甘油磷酸脱氢酶(His3p),能使酵母正在组氨酸缺点培养基上发展。3-氨基-1,2,4三唑(3-AT)是His3p的竞争性抑制剂,His3p表达程度下的细胞能正在含有较下3-AT浓度的培养基上发展,因而,酵母细胞对3-AT的抑止程度表现了卵白-卵白相互作用的强度。

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 1 卵白三杂交体系

Fig. 1 protein-dependent three-hybrid system


取酵母双杂交体系差别,三杂交是研讨两个卵白和第三个身分间的相互作用,经由过程第三个份子使两个纯合卵白互相接近。第三个身分差别,能够是卵白、RNA或小份子。正在以卵白为根蒂根基的三杂交体系中,卵白XY的稳固相互作用依赖于卵白Z的存在,Z介导相互作用或引诱一个卵白的构象改动(如X),从而增进取另一个卵白Y的相互作用(图1)。正在以RNA为根蒂根基的三杂交体系中,DNA联合域(LexA BDGal4 BD)取RNA联合卵白(如MS2-外壳卵白或Hiv-1 RevM10)融会成第一个纯合卵白,转录激活域(Gal4 AD)取感兴趣的RNA联合卵白Y融会成第二个杂合卵白。第三个杂合RNA份子包含取第一个RNA联合卵白(MS2RRE)联合的位点(RNA)和RNA联合卵白Y联合的位点X。卵白YRNA联合位点X联合构成具功用的转录激活子(图2)。正在小份子三杂交体系中,第三个杂合份子为异源二聚化的小份子复合物(如Dex–FK506DeX-Mtx,使BD-XAD-Y融会卵白互相接近,从新构成具有功用的转录激活子(图3)。正在SenGupta[1] 最早提出的三杂交体系中,第一个纯合卵白LexABD-MS2由酵母的L-40膜蛋白编码,第二个杂合卵白Gal4AD-Y由质粒表达,纯合RNA 份子由RNA聚合酶Ⅲ发生,包孕RNAse P 5′前导序列和3′尾随序列(位于mRNA停止密码子后)。RNA聚合酶Ⅲ含有一段由4个或多个T残基构成的转录停止子,而很多RNA 联合卵白辨认富含URNA靶标,不克不及被RNA聚合酶Ⅲ转录。Putz[2]应用RNA聚合酶Ⅱ转录RNA纯合份子,从而制止富含U的靶RNAs成熟前的转录停止。


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                                                  图2 RNA介导的三杂交体系                                      图3 小份子三杂交体系

                                Fig.2  RNA-dependent three-hybrid system            Fig.3 Small molecule three-hybrid system

2. 我们的事情内容

    您只需供应用于挑选的钓饵质粒信息,我们会完成全部的挑选事情,重要包孕以下内容:
2.1 钓饵载体的构建
2.2 钓饵质粒的自激活检测
2.3 文库质粒和钓饵质粒共转酵母感受态细胞
2.4 文库挑选和3AT优化
2.5 文库挑选效果测序剖析
2.6 挑选效果回转考证
2.7 具体讲演的整顿和数据发送

3.托付效果

供应具体的、完好的实行讲演,清楚的实行图片,挑选效果的测序效果,质粒等。

4.服务报价

3.2万元整

5.服务周期

80个工作日


文库构建

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