基因组酵母单(单)杂交文库构建

宝凶生物供应基因组样本的酵母单(单)杂交文库构建服务,插入片断长度能够由您指定。

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服务报价:3.2万元整,免费赠予3个读码框处置惩罚,以确保卵白能够一般表达。

能够挑选增添供应转化到酵母的文库,能够供应充足100次挑选的酵母转化菌液文库,同时借会供应质粒文库。

服务工夫:25个工作日内 


“自1989年Field等人竖立了第一个基于酵母的细胞内检测卵白相互作用的体系以来,酵母双杂交体系曾经愈来愈多的应用于审定新的卵白取卵白相互作用,审定卵白级联底物和审定突变对卵白取卵白联合的影响等。有文献统计,现在已知的蛋白质相互作用最少有一半是经由过程酵母双杂交实行发明的!” 而文库挑选效果间接由文库质量的优劣所决意,构建出下质量的文库是获得好的挑选效果的关键因素。

       我们具有多年的文库构建履历,已完成数千个各种文库构建,所接纳的手艺和试剂盒均为市场上下质量的文库构建试剂,我们构建文库的成功率为98%以上。
      上海海科联合多年的文库构建履历,强势推出“All-Direct”文库构建手艺,我们的产物较其他构建要领(重要有takara的SAMRT要领和invitrogen的gateway要领),手艺和质量上皆具有肯定的上风。


一、产物质量标准取报价:
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      关于我们的文库构建产物,我们许诺的目标以下: 

原始文库库容量大于1*10^7CFU;
均匀插入片断大于1200bp ;
克隆阳性率大于95%。
 
二、手艺特性取技术优势:

       1.我们是接纳同源重组的要领构建文库,没有经由任何的内切酶切割和衔接历程,确保不会泛起基因被酶切切断的状况,可以或许包管基因的完整性,而Clonetech的是用酶切衔接的体式格局构建的。 

       2.因为我们接纳的是重组的体式格局把cDNA重组到载体上,相对clonetech的SMART的T4连接酶的要领效力要下的多,我们许诺原始库的库容量正在1*10^7以上。并且重组的体式格局假阳性很低,我们这里有的客户一次测3万个克隆,皆没有泛起一个空载的状况,我们许诺阳性率大于98%,这是酶切衔接的要领远远没法相比的。 

       

文库构建流程: 
1.基因组DNA的提取 
2.基因组DNA的打断
3.DNA衔接讨论 
4.DNA按长度星散 
5.DNA取酵母双杂交文库载体(pGADT7大概pDEST22)停止all-direct重组 
6.重组产品电转化 
7.文库检测和质粒提取
 
三、手艺具体对照:

1.取Clonetech(Takara)的SAMRT要领手艺对照:

步调SAMRT要领我们的All-Direct要领我们的上风
基因取载体的衔接酶切衔接高效率的体外同源重组酶停止重组SMART要领运用酶切衔接大概酵母细胞内的低效率重组的体式格局,停止片断取载体的衔接,效力低下,假阳性率下,原始文库的库容正在1*10^5CFU-1*10^6CFU.我们运用高效率的体外重组体式格局,大大进步重组效力,文库的原始库容大于1*10^7CFU.
酵母文库的托付转化到酵母细胞的文库菌文库混淆质粒大概转化到酵母细胞的文库菌我们的产物能够自由选择是托付文库质粒大概转化到酵母细胞的文库菌,因为酵母菌不容易临时生存,一样平常生存凌驾半年,文库的质量便大大低落,发起以文库质粒的体式格局临时生存,生存工夫能够达10年以上。
文库的用处酵母双杂交,酵母单杂交酵母双杂交,酵母单杂交,膜蛋白酵母双杂交,酵母三杂交,细菌双杂交,本核表达文库,实核表达文库,缓病毒包装文库…SMART要领因为其手艺缘由,只能构建酵母双杂交和酵母单杂交文库,而我们的体系能够构建出任何用处的文库,只要有可用的载体体系便可。
文库的多用途我们的文库产物,能够轻易的将文库再经由过程简朴的体式格局转移到其他恣意载体上构成其他用处的文库,而不需要从新构建文库,大大进步文库的运用局限和低落文库构建的本钱。
文库的运用次数30-80次最少500次以上SMART要领托付的是转化到酵母细胞的文库,且总量一样平常便50-100ml,只够做几十次的挑选,且用完便出有了,弗成以复制。我们托付的产物,包孕了下库容的大肠杆菌菌液和文库质粒,若是全部运用完,最少能够够做500次以上的挑选,且能够简朴复制,理论上是不可能用完的,大大进步经济性。
文库产物目标均匀插入片断:600-800bp;
库容量:1-5*10^5CFU;
空载率小于10%
均匀插入片断大于1200bp;
库容量大于1*10^7CFU;
空载率小于5%
我们的要领正在原始库容和均匀插入片断上皆比takara的SMART的要领下许多



2. 取invitrogen的构建要领对照


步调invitrogen要领我们的All-Direct要领我们的上风
基因取载体的衔接gateway要领all-direct要领gatway要领取我们的all-direct要领都是基于下纯度的同源重组酶,两者皆属于同源重组体系,正在重组效力上没有差别,差别在于,gateway要领需求经由两步重组才气装到目标载体上,那是由其手艺瑕玷决意的,我们的all-direct要领是一步间接重组到目标载体上。因为gateway要领需求多一次重组,便需求多一次的重组回响反映和文库甘油菌的扩增和质粒提取,特别是文库扩增阶段,因为文库的扩增会存在类似于PCR扩增的竞争性抑制,会形成低丰度的基因和少片断的基因丧失,每多做一次扩增和质粒提取,文库的插入片断均匀下落200bp阁下。
文库质粒提取液体造就铺板扩增提取invitrogen要领运用液体造就的体式格局停止文库的扩增和提取,因为摇菌历程中的竞争性抑制,会形成低丰度的基因和少片断的基因丧失,每多做一次扩增和质粒提取,文库的插入片断均匀下落200bp阁下。而我们运用铺板扩增的体式格局,确保每一个克隆都是自力发展的状况,制止的基因间的竞争性抑制,大大低落基因丧失的状况。
文库产物目标均匀插入片断大于1000bp;
库容量大于0.5*10^7CFU;
空载率小于5%
均匀插入片断大于1200bp;
库容量大于1*10^7CFU;
空载率小于5%
我们的要领正在原始库容和均匀插入片断上皆比invitrogen的要领下许多。






































四、托付效果:

       我们的酵母双杂交文库能够自由选择运用pGADT7(Clonetech,推荐)大概pDEST22(invitrogen)载体,托付的产物以下:

产品名称托付保准包装情势贮存前提
酵母双杂交文库甘油菌库容:大于1*10^7CFU
均匀插入片断:大于1200bp
阳性率:大于95%
1.5ml螺旋管-80℃
酵母双杂交文库质粒大于500ug1.5ml螺旋管-80℃
文库构建讲演电子版Word和PDF花样常温
文库构建图片电子版JPG花样常温
转化到酵母细胞的文库甘油菌(可选)100ml
库容大于:1*10^8CFU/ml
离心管-80℃


五、服务工夫:

      25个工作日内,如需转化酵母延伸15个工作日。
备注1:该酵母文库能够挑选增添均一化处置惩罚步调,我们运用DSN法均一化要领,能够构建出下质量的均一化酵母杂交文库,能够大大削减后续酵母挑选的工作量和挑选效力等。  

六、质料要求:
        客户构建指定的酵母双杂交cDNA文库,由客户供应构造、细胞或总RNA给我们便可:
 细胞样本:细胞数目大于1*10^7 
 植物样本:大于1g 
 动物样本:大于2g 
 DNA:大于20ug 

七、客户案例:

       现在我们曾经胜利完成数千个不消样本的文库构建,重要客户为中国科学院上海动物心理生态研究所、上海交通大学、浙江大学、浙江省农科院、山东省农科院等多家单元完成酵母单(单)杂交文库构建服务,物种包孕人、小鼠、大鼠、水稻、拟南芥、牡丹、稻飞虱、苹果、油菜、小麦、贝壳、葡萄、真菌等。

八、文库挑选:
       我们是海内少数能同时供应文库构建和文库挑选的公司,关于酵母双杂交挑选服务,您只需求供应钓饵基因序列便可,我们会停止以下事情,挑选的报价为3万元整:

1.钓饵载体的测序考证和构建到双杂交挑选载体上
2.钓饵基因的自激活检测,检测经由过程后继承下一步实行。
3.钓饵质粒转化酵母细胞,考证及格后再转化文库质粒
4.酵母挑选和3AT前提优化
5.挑选效果的测序
6.挑选效果的回转考证
7.挑选效果递交:包孕挑选讲演,挑选效果的测序效果和blast效果,挑选效果克隆的质粒什物。

九、FAQ:

9.1. 怎样挑选适宜的文库构建要领停止建库?

      我们是能够同时供应3种文库构建要领的公司,那也足以看出我们公司的手艺气力。
3种要领的对照以下:

      1) Clonetech 的SMART要领,该要领根基是被镌汰的,我们上文有具体的手艺对照,其为数不多的优点就是RNA的肇端量能够很小,一样平常只需求几ug便可,该要领本钱很低,一样平常不发起挑选。

      2) Invitrogen的要领,该要领质量上较SMART要领要好许多,其对试剂的质量要求也很高,需求全部运用invitrogen的本厂试剂。我们全部运用invitrogen公司试剂停止构建,且做了一些手艺革新,进步了文库质量。该要领对肇端的RNA要求较下,发起肇端用量是大于200ug。但该要领有一个严峻的瑕玷,就是需求停止两次重组才气获得酵母文库,而多一次重组就会多一次文库扩增历程,会严峻影响文库质量。正在上文中有具体的手艺对照和引见。
       其余运用该要领建库的公司,只能运用商业化的试剂盒构建文库,没有做任何革新。且因为进货渠道的缘由,试剂盒内的有些试剂他们是购不到的,质量就会大打折扣。好比DH10B 电转化感受态细胞,这个感受态细胞转化效力比国产的下出100倍以上。这个感受态细胞需求具有一堆的海关批文才气购到,其他公司因为没有相干天资,是没法入口的,据我们相识,海内某公司竟然会用化学转化细胞替代电转化,质量影响伟大。

       3) All-Direct要领,这个是我们的革新要领,是正在invitrogen要领上做了主要革新,保存了其长处(不消PCR扩增,文库保真度下),去除了其需求经由两次重组的瑕玷,大大进步文库质量。均匀长度较invitrogen要领能够进步200bp,库容量能够进步10倍以上。该要领对RNA的要求量和invitrogen要领一样。

9.2. 海科生物供应的酵母单杂文库有哪些产物内容?

       我们供应的文库产物,包含了文库质粒(大于500ug)和大肠杆菌文库甘油菌。同时能够挑选供应转化到酵母细胞的文库甘油菌,我们会供应100只转化到酵母细胞的文库甘油菌,能够做100次的文库挑选。
       个中文库质粒能够运用共转的要领停止文库挑选,酵母细胞文库甘油菌能够运用maiting的要领停止文库挑选,凭据先生的实行风俗能够自由选择,效果没有任何差别的。

9.3. 怎样检测文库质量?

       关于文库的质量,一个简朴的金尺度就是,样本内的所有基因皆正在文库里,且基因要有一半以上的全长基因,这个文库就是及格的。
       关于文库的检测,能够针对我们托付的产物,做以下几个方面的检测:
       凭据先生的样本信息,挑选3-5个低拷贝的基因,设想分解引物,以我们供应的文库质粒为模板,停止PCR扩增,若是低拷贝的基因皆能扩增出来,下拷贝的便不会丧失,文库质量便可以判定为及格。
        关于我们供应的大肠杆菌文库甘油菌,能够停止梯度稀释后铺板造就,第二天盘算库容量,同时挑与单克隆停止PCR扩增和测序检测,以判定插入片断长度和空载率。

9.4. 怎样评价文库质量?

       文库质量的要害目标,重要是文库库容、空载率及插入片断均匀长度。
       文库的原始库容一定是越高越好,我们公司许诺的是大于1*10^7的库容量,这个是原始库容量,也就是没有经由任何扩增历程,间接转化出来的库容量。比其他公司许诺的1*10^6的库容量要高10倍以上,上面具体注释下库容量的上下对文库质量的影响:
       生物样本,除低等生物,现在研讨对照多的物种,好比人,大鼠,小鼠,其基因数正在5*10^4阁下,文库最少得100倍掩盖,也就是库容最少需求5*10^6以上。
       关于动物样本,其基因数目比人的大许多,好比水稻样本,其基因数目为人的2-3倍,小麦样本,其基因数目为人的5-6倍,如许便需求更多的文库库容量。关于水稻样本,需求掩盖100倍的基因数,要求的文库原始库容量是大于1*10^7以上。市场上其余公司供应的文库只能掩盖10倍阁下,这么低的掩盖度,一定形成大量基因的丧失。
       关于有的公司宣扬的,库容量不是越高越好,那绝对是不负责任的忽悠,为本身的文库质量不合格找不合理的托言。
       关于插入基因长度,其余公司一样平常均匀长度便正在800bp阁下,我们公司能够许诺做到1200bp以上,这个差异是伟大的,上面再具体引见下插入片断长度对文库质量的影响:
      一样平常的一个功用基因,其一样平常长度会正在200个氨基酸以上,也就是编码区正在600bp碱基以上,装入文库的基因,除编码区,还会有5’UTR区,3‘UTR区和polyA地区,那几个局部加起来,基因的长度一样平常最少会正在1000bp以上。因为文库是个混合物,会存在竞争性抑制,短的基因过多,必将会影响长度基因的比例,和少的基因的表达歉度。
       我们的文库产物,插入片断均匀长度会正在1200bp以上,短的会正在1000bp阁下。关于文库挑选,不是道只要有基因的一个片断便能够了,蛋白质的功用需求多种身分的到场,若是插入基因过短,挑选到的效果只是一个基因片断,以至是接近polyA的一小段基因,这个效果的可行度正在那里?根基皆能够以为是假阳性的效果的。
       关于有些公司声称的,文库的基因插入片断不是越长越好,实在是对客户的极为不负责任和不合理的忽悠,只是由于本身没有手艺做到更长的片断长度,而找的来由。

9.5. Mating和共转两种筛库要领哪种好?

       共转和maiting两种要领,结果是一样的,只是一个文库质粒转到酵母细胞的要领,关于后续的文库挑选没有区分的,能够凭据先生的实行风俗,自由选择的。


9.6 公司文库构建履历有多久?

       本公司处置各种文库构建和挑选长达10多年,特别是酵母文库,是海内一向本身做文库构建和挑选的公司。不像有的公司声称有10多年文库构建履历,实际上真实情况是其invitrogen体系的文库构建履历只要2-3年,2-3年前其所有的invitrogen体系文库都是外包给某公司做的,只是个二道贩子罢了,因为本身一向做欠好,才不能不一向外包。文库构建和挑选,履历很重要,少的履历积聚,能够包管产品质量和稳定性,一次成功率等。


十、客户文章示例

核蛋白酵母双杂交文库客户文章示例:

【1】Yeast-2-Hybrid data file showing progranulin interactions in human fetal brain and bone marrow libraries[J],Data in Brief, Volume 9, December 2016, Pages 1060-1062

【2】Zhenhai Yu, Yingying Ge, Lei Xie,et al. Using a yeast two-hybrid system to identify FTCD as a new regulator for HIF-1α in HepG2 cells[J],Cellular Signalling, Volume 26, Issue 7, July 2014, Pages 1560-1566

【3】Zhanyang Yu,1 Ning Liu,1 Yi Wang,2 Xiaokun Li,et al. Identification of Neuroglobin-interacting Proteins Using Yeast Two-hybrid Screening. Neuroscience. 2012 Jan 3; 200: 99–105.

【4】Cui LG, Shan JX, Shi M, et al. DCA1 Acts as a Transcriptional Co-activator of DST and Contributes to Drought and Salt Tolerance in Rice. PLoS Genet. 11, e1005617 (2015).

【5】Jing Ning, Baocai Zhang, Nili Wang, Increased Leaf Angle1, a Raf-Like MAPKKK That Interacts with a Nuclear Protein Family, Regulates Mechanical Tissue Formation in the Lamina Joint of Rice. The Plant Cell, Vol. 23: 4334–4347, December 2011.

【6】Raksha Singh, Mi-Ok Lee, Jae-Eun Lee, Jihyun Choi, Rice Mitogen-Activated Protein Kinase Interactome Analysis Using the Yeast Two-Hybrid System. Plant Physiology, September 2012.Vol.160,

【7】X.F.Zha,M.Zhao, C.Y.Zhou, H.Z.Guo. Analysis of interaction between Bmhrp28 and BmPSI in sex-specific splicing of Bombyx mori Bmdsx gene. Genetics and Molecular Research 13 (3): 5452-5462 (2014)

【8】Chao Zhang, Rongchao Ge, Junwen Zhang, Identification and Expression Analysis of a Novel HbCIPK2-Interacting Ferredoxin from Halophyte H. brevisubulatum.PLOS. December 4, 2015.

【9】Deng X1, Guo D2, Yang S1, Shi M1, Chao J1, Li H2, Peng S2, Tian W1. Jasmonate signalling in the regulation of rubber biosynthesis in laticifer cells of rubber tree, Hevea brasiliensis. J Exp Bot. 2018 Jun 27;69(15):3559-3571. doi: 10.1093/jxb/ery169.


酵母单杂交文库客户文章示例:

【1】Nobutaka Mitsuda,Miho Ikeda,Shinobu Takada,et al.Efficient Yeast One-/Two-Hybrid Screening Using a Library Composed Only of Transcription Factors in Arabidopsis thaliana.Plant Cell Physiol (2010) 51 (12): 2145-2151.

【2】Chang-Qing Yang1, Xin Fang1, Xiu-Ming Wu1, et al. Transcriptional Regulation of Plant Secondary Metabolism. Journal of Integrative Plant Biology 2012, 54 (10): 703–712

【3】Zejun Huang, Zhijin Zhang, Xiuling Zhang,et al. Tomato TERF1 modulates ethylene response and enhances osmotic stress tolerance by activating expression of downstream genes. FEBS Letters.Volume 573, Issues 1–3, 27 August 2004, Pages 110-116

【4】Deng X1, Guo D2, Yang S1, Shi M1, Chao J1, Li H2, Peng S2, Tian W1. Jasmonate signalling in the regulation of rubber biosynthesis in laticifer cells of rubber tree, Hevea brasiliensis. J Exp Bot. 2018 Jun 27;69(15):3559-3571. doi: 10.1093/jxb/ery169.

膜蛋白双杂交文库客户文章示例:

【1】Yasuyuki Nakamura, Jun Ishii, Akihiko Kondo. Rapid, Facile Detection of Heterodimer Partners for Target Human G-Protein-Coupled Receptors Using a Modified Split-Ubiquitin Membrane Yeast Two-Hybrid System.PLOS one. June 2013 , Volume 8 ,Issue 6.

【2】Zhe Ma, Hui Zhang, Junxi Zheng. Interaction between M-Like Protein and Macrophage Thioredoxin Facilitates Antiphagocytosis for Streptococcus equi ssp. Zooepidemicus.PLOS one. February 2012 ,Volume 7, Issue 2.

【3】Pratima Pandey and Singh Harbinder. The Caenorhabditis elegans D2-like dopamine receptor DOP-2 physically interacts with GPA-14, a Gαi subunit. Pandey and Harbinder Journal of Molecular Signaling 2012.

 中文论文:

【1】张云云,周 君, 李 晔. 适口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)酵母双杂交文库和铁联合卵白实核表达载体的构建. 陆地取湖沼,44卷,第6期。

【2】欧阳沫, 唐潇,黄惜,袁红梅。巴西橡胶树HbICE1 基因酵母双杂交钓饵载体的构建及互做卵白的挑选。动物科学学报,2016,34(2): 255~262.

【3】岳珊珊,夏来新。酵母双杂交挑选取果蝇C(2)M相互作用的卵白。遗传,2015.11,37(11)

【4】专利:一种联合串连反复序列(TTTACAC)5的Dof蛋白质



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